CART疗法在崛起中的发展墨盒墨水
文章来源：友胜机械网 | 2022-09-26
CAR-T疗法在崛起中的发展
虽然基因编辑技术在过去几年中已经爆发，但另一种基因调控技术也在加速：RNA干扰（RNAi）。RNAi通过与基因相应的mRNA分子结合来干扰基因表达，而不是像CRISPR等基因编辑器那样物理地改变DNA序列。与基因编辑不同，RNAi不是一个完整的“开/关”开关，因为它不会永久改变遗传密码，可能允许少量的基因表达中国机械网okmao.com。
除了被探索作为新的治疗途径之外，RNAi可用于改变细胞中的基因表达并产生细胞疗法，例如CAR-T疗法。
CAR-T治疗基础和其他同种异体CAR-Ts的发展
CAR-T细胞是经过工程改造以表达识别特定类型癌细胞的受体（称为嵌合抗原受体或CAR）的T细胞。这些改变的T细胞现在可以特异性地识别和攻击癌细胞。用于产生CAR-T细胞的细胞工程通常通过使用病毒载体将所需DNA添加到细胞中来实现，但也可以通过基因编辑和RNAi实现。
目前批准的CAR-T疗法是自体的或患者特异性的，因此它们不能用于多个患者。下一个主要障碍将是批准同种异体或“现成的”CAR-T疗法。同种异体CAR-T细胞是理想的，因为它们可以从健康的供体细胞产生，经过工程改造以表达所需的CAR，然后用于任何患者。
大多数其他同种异体CAR-T疗法涉及用CRISPR或转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）进行基因编辑。Cellectis正在开发四种同种异体（或“通用”）CAR-T疗法：UCART123，用于治疗CD123 +白血病细胞，例如大多数急性髓性白血病（AML）患者，目前正在进行成人AML的1期试验。耐心; UCART22，TALEN基因编辑的CAR-T细胞，用于治疗CD22 +急性淋巴细胞白血病（ALL）前体B细胞，目前正处于成人B细胞ALL患者的1期试验中; UCARTCS1，基因编辑的CAR-T细胞用于治疗CS1 +血液系统恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤（MM），已被FDA批准为开始临床试验; 和UCARTCLL1，基因编辑的CAR-T细胞，用于治疗CLL1 +血液系统恶性肿瘤，如AML，这是一种临床前发展。
Cellectis，Allogene和Servier也联合开发了两种同种异体CAR-T疗法：UCART19，TALEN基因编辑的CAR-T细胞，用于治疗CD19 +血液系统恶性肿瘤，如ALL，这是针对儿科ALL患者（PALL）和成人ALL患者（CALM）; 和ALLO-501，基因编辑的CAR-T细胞，用于治疗CD19 +非霍奇金淋巴瘤（NHL），这是一项针对成人NHL患者的1期试验。Cellectis和Allogene也致力于另外两种同种异体CAR-T疗法：ALLO-715，用于BCMA +的基因编辑的CAR-T细胞MM，目前正处于临床前开发阶段; 和ALLO-819，用于治疗表达FLT3的AML的基因编辑的CAR-T细胞，其处于临床前开发阶段。
同种异体基因还开发了一些其他同种异体CAR-T疗法：CD70，用于血液系统恶性肿瘤和肾细胞癌（RCC）的临床前开发; DLL3，用于小细胞肺癌（SCLC）的临床前开发; ALLO-647，一种抗CD52单克隆抗体，用于成人NHL ALLO-501的1期研究中用作淋巴细胞清除剂（一种降低淋巴细胞数量的药物，介导移植排斥，以防止排斥）耐心。
CRISPR Therapeutics 还开发了三种同种异体CRISPR / Cas9基因编辑的CAR-T疗法，其中包括用于表达CD19的B细胞恶性肿瘤的CTX110，这种方法可用于临床前IND启动; 用于表达BCMA的MM的CTX 120，其处于临床前IND启动发展中; CTX130用于表达CD70的血液系统恶性肿瘤（如某些淋巴瘤）和实体瘤（如RCC），它们处于临床前开发阶段。
使用RNAi创建现成的CAR-T疗法
现在，生物技术公司Celyad 正在寻找一种非基因编辑方法，使用RNAi创建同种异体CAR-T细胞。去年10月，Celyad宣布与Horizon Discovery公司的shRNA专家Dharmacon合作，利用其优化的shRNA技术创建CAR-T疗法。
为了成功进行同种异体CAR-T治疗，您必须确保供体CAR-T细胞不会与健康的宿主细胞发生非特异性反应。Celyad采用各种方法，包括shRNA，通过阻断称为CD3-zeta的复合物中特定蛋白质的表达来敲除T细胞中的T细胞受体（TCR）复合物。TCR复合物由八种蛋白质组成，这些蛋白质在T细胞表面上组合在一起并且对T细胞的功能很重要。没有CD3-zeta蛋白，TCR复合物在T细胞表面上不能正确表达，并且不能正确传递信号。这意味着供体来源的修饰T细胞不应攻击宿主自身的细胞，这是一种称为移植物抗宿主病（GvHD）的并发症。
根据Celyad首席执行官Filippo Petti的说法，大多数基因编辑都集中在TCR复合体的另一个组成部分，称为TCRα链。尽管shRNA可用于敲除TCR复合物的多种组分，但Celyad选择专注于阻断CD3-zeta表达，因为它是TCR复合物表达中的“限速步骤”。Petti表示他们使用shRNA进行TCR复合物敲低，与使用CRISPR / Cas9基因抑制相当。
Celyad设计T细胞来表达携带NKG2D受体的CAR，该受体识别在许多类型的癌细胞上过表达的某些应激标记物。最初，他们专注于成人急性髓性白血病（AML），骨髓增生异常综合征（MDS）和多发性骨髓瘤（MM）。
为了将所有必需的成分导入T细胞，他们使用一体化载体编码CAR，shRNA和一个标签，允许阳性选择表达两种成分的细胞（CAR和shRNA）。这种筛选方法是独特的，因为只能对基因编辑的CAR-T细胞进行阴性选择，以验证所需的基因被敲除。同时具有阳性筛选（通过载体编码标签的表达）和阴性筛选（通过TCR复合物敲低）允许Celyad有效地选择正确的CAR-T细胞。
“SMARTvector”平台由Dharmacon开发和优化，Dharmacon筛选天然存在的人类microRNA以选择支架，该支架不仅允许从载体中有效加工shRNA和所有载体组分的表达，而且还不会过度表达反义shRNA，从而避免细胞毒性。
非基因编辑的CAR-T疗法如何在诊所中发挥作用？
在小鼠中，基因编辑和shRNA修饰的CAR-T细胞都阻止了主要的体重减轻，这是GvHD的典型特征，并且显示出相似的存活率。
有趣的是，使用shRNA产生的CAR-T细胞比使用CRISPR / Cas9产生的细胞持续时间更长。Petti假设，因为shRNA不是严格的“开 - 关”开关，shRNA修饰的T细胞仍然可以允许一些TCR复合物信号传导。这将使T细胞保持“快乐，持久和复制 - 保持T细胞表现得像T细胞”，而不是像基因编辑那样完全关闭信号。值得注意的是，关闭足够的TCR复合物信号以降低小鼠GvHD的可能性。
将这种较长的持久性（可能持续时间较长）与使用单一的一体化载体进行配对并积极选择正确表达的细胞，可使shRNA产生的CAR-T细胞比CRISPR基因更容易和更便宜编辑CAR-T细胞。
“shRNA可能是一种破坏因素有两个原因：shRNA修饰的CAR-T细胞比基因编辑的CAR-T细胞更具持久性，这可能对临床和shRNA已确立的病史有益，”Petti告诉BioSpace。“RNAi已经存在了大约20年，它已经过优化，并且已经有其他RNAi技术可供研究和应用。”
Celyad的CAR-T治疗方法
他们的主要候选人CYAD-01，一种使用他们的NKG2D CAR技术的自体CAR-T疗法，已经被证明在正在进行的阶段1/2（THINK），阶段1（DEPLETHINK）和阶段1（SHRINK）试验中具有良好的耐受性用于治疗血液系统恶性肿瘤（AML，MDS和MM）和实体瘤（结肠直肠癌，卵巢癌和胰腺癌）。
这些结果是积极的，因为Celyad正在开发基于这种NKG2D CAR技术的其他CAR-T疗法，例如CYAD-101，一种利用其TCR抑制分子（TIM）破坏TCR复合物信号传导的同种异体CAR-T疗法。TIM是CD3-zeta蛋白的截短形式，其干扰TCR复合物信号传导。它是shRNA的替代方法，可防止供体CAR-T细胞与宿主细胞反应，最终防止不需要的严重副作用，如GvHD。CYAD-101目前正在开展一项开放标签的1期临床研究（alloSHRINK），研究36例转移性结直肠癌患者。
Celyad还在开发CYAD-200系列新型非基因编辑的基于shRNA的CAR-T疗法。使用“SMARTvector”技术产生CYAD-200疗法以表达靶向CD3-zeta的CAR和shRNA以敲低TCR复合物。
对于200系列，Celyad正在开发三种一流的同种异体非基因编辑的CAR-T疗法：CYAD-211针对B细胞成熟抗原（BCMA）治疗MM（预计将于2020年中期进入临床） ; CYAD-221靶向CD19治疗B细胞恶性肿瘤（预计将于2020年底进入临床）; 和CYAD-231靶向NKG2D和未公开的膜蛋白，以治疗未公开的疾病（预计将于2021年初进入临床）。